OBTENÇÃO DE VATERITA ESTABILIZADA PARA APLICAÇÃO EM
SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA DE FÁRMACOS

Obtaining Stabilized Vaterite for Application in Drug Delivery Systems

RESUMO

Nas últimas décadas, avanços no campo das
ciências e tecnologias aplicadas têm emergido, com pesquisas na área inovadora
e multidisciplinar conhecida como nanobiotecnologia,
referindo-se às tecnologias em que a matéria é manipulada às escalas atômica e
molecular para criar novos materiais com características funcionais diferentes
dos materiais comuns. O desenvolvimento destas tecnologias para aplicação em
sistemas biológicos almeja viabilizar a utilização prática desse conhecimento
nas áreas da saúde. A Terapia Fotodinâmica (TFD) se configura como uma terapia
promissora para o tratamento de diversas doenças, baseado em fotoprocesso onde um fotossensibilizador
é ativado por luz visível, em um comprimento de onda adequado, na presença de
oxigênio molecular. Essa combinação é responsável por gerar espécies reativas
de oxigênio (EROs) e oxigênio singlete,
levando a morte do tecido alvo devido a uma cascata de eventos biológicos. Porém,
muitos dos fotossensibilizadores apresentam baixa
solubilidade em meio fisiológico, deste modo, faz-se necessária a utilização de
sistema de liberação controlada.  Neste
âmbito, destaca-se o processo de síntese das micropartículas precipitadas de
carbonato de cálcio (CaCO3) de maneira controlada, buscando
favorecer a nucleação e o crescimento de um determinado polimorfo de CaCO3.
O objetivo do trabalho foi controlar os parâmetros na síntese das
micropartículas, como supersaturação das soluções, agitação, adição de agentes
estabilizantes, buscando as condições ideais para a obtenção das
micropartículas esféricas na fase de vaterita (µ-CaCO3).
A avaliação dos protocolos foi assistida por microscopia eletrônica de
varredura a fim de determinar o processo que atingiu a estabilização da fase de
vaterita.

Palavras-chave: CaCO3.
Vaterita. CMC. PSS. Estabilização de fase.

ABSTRACT

In the last
decades, advances in the field of applied sciences and technologies have
emerged, with research in the innovative and multidisciplinary area known as
nanobiotechnology, referring to technologies in which matter is manipulated at
the atomic and molecular scales to create new materials with different
functional characteristics. common materials. The development of these
technologies for application in biological systems aims to enable the practical
use of this knowledge in the areas of health. Photodynamic Therapy (PDT) is a
promising therapy for the treatment of various diseases, based on a photoprocess where a photosensitizer is activated by
visible light, at an appropriate wavelength, in the presence of molecular
oxygen. This combination is responsible for generating reactive oxygen species
(ROS) and singlet oxygen, leading to the death of the target tissue due to a
cascade of biological events. However, many of the photosensitizers have low
solubility in a physiological environment, so it is necessary to use a
controlled release system. In this context, the process of synthesis of
precipitated microparticles of calcium carbonate (CaCO3) stands out in a
controlled manner, seeking to favor the nucleation
and the growth of a specific CaCO3 polymorph. The objective of the work was to
control the parameters in the synthesis of microparticles, such as
supersaturation of solutions, agitation, addition of stabilizing agents,
seeking the ideal conditions for obtaining spherical microparticles in the vaterite phase (µ-CaCO3). The evaluation of the
protocols was assisted by scanning electron microscopy in order to determine
the process that reached the stabilization of the vaterite
phase.

Keywords: CaCO3. Vaterite. CMC. PSS. Phase
stabilization

1
INTRODUÇÃO

A terapia fotodinâmica
(TFD) é uma emergente modalidade terapêutica relativamente nova para o
tratamento de doenças neoplásicas e não neoplásicas, como candidíase, herpes e
AIDS (SIBATA et al., 2000; SOLBAN,
2006). A técnica é baseada na ativação de compostos fotossensíveis, chamados de
fotossensibilizadores (FS), com luz visível em um
comprimento de onda adequado (janela terapêutica – 600 a 800 nm) e que na presença de oxigênio molecular, produz
espécies reativas de oxigênio, como o oxigênio singlete,
considerado a principal espécie citótoxica em TFD,
levando a morte celular do tecido alvo, devido a uma sucessão de eventos
biológicos, incluindo citotoxicidade direta, dano vascular e resposta do
sistema imunológico (ALEXIADES-ARMENAKAS, 2006; ROCHA, 2017).

O processo fotodinâmico é
iniciado pela absorção de luz pelo FS no estado fundamental, o qual é promovido
para um estado excitado de vida curta. A partir deste estado, o FS pode
retornar para o estado fundamental, pela emissão de luz (fluorescência) ou pode
sofrer um cruzamento intersistema para o estado
excitado triplete, o qual é mais estável e apresenta
tempo de vida mais longo (AGOSTINIS, 2011; HUANG et al., 2012).

Existem dois mecanismos
principais da reação fotodinâmica. Ambos são intimamente dependentes das
moléculas de oxigênio dentro das células. O primeiro estágio de ambos os
mecanismos é semelhante. O fotossensibilizador,
depois de entrar na célula, é irradiado com um comprimento de onda de luz que
coincide com o máximo de absorção do FS e é convertido do estado fundamental singlete para o estado singlete
excitado por causa da absorção de fótons (ROBERTSON,2009). Parte da energia é
perdida na forma de fluorescência, e a energia restante direciona uma molécula
de fotosensibilizador para o estado tripleto excitado
- a forma terapêutica adequada do composto (CASTANO, 2005).

Os fotossensibilizadores
(FS) são compostos atóxicos ou pouco tóxicos, que em seu estado fundamental são
inativos e apresentam a característica de absorção da luz nas regiões do infravermelho,
visível ou radiação ultravioleta (JORI, 2006) e possuem a capacidade de induzir
ou de participar de mecanismos fotoquímicos e fotoprocessos
(MACHADO et al., 2000; PERUSSI,
2007).

Entretanto, a maioria dos
fotossensibilizadores de segunda geração, são
altamente hidrofóbicos, apresentando baixa solubilidade em água, ou seja, em
solventes fisiologicamente compatíveis. Uma vertente para solucionar esse
problema de solubilidade em soluções aquosas causado por sua elevada hidrofobicidade, é a incorporação desses compostos
bioativos em diferentes sistemas de liberação controlada, chamados de drug delivery systems (DDS) (CARVALHO et al., 2018).

Uma das ferramentas para
a eficácia da TFD destaca-se a tecnologia de liberação controlada de fármacos a
qual representa uma das fronteiras da ciência, um incremento notório na
tentativa de maximizar as vantagens inerentes às formas farmacêuticas
tradicionais e como isso pode contribuir muito para o avanço da saúde humana.

Atualmente os materiais
porosos estão surgindo como uma nova categoria de sistema de entrega de
compostos bioativos devido a suas características diferenciadas e a
estabilidade biológica e sua propriedade de liberação controlada (COSTA et al., 2017).  Estes materiais possuem uma vasta quantidade
de nanoporos que permitem a inclusão de compostos
bioativos neles. Vários minerais porosos têm sido estudados como nanopartículas
de sílica porosa, poros de hidroxiapatita e poros de carbonato de cálcio.

As micropartículas de
CaCO3 porosas podem ser eficazes para a fabricação de materiais
compósitos biocompatíveis devido a sua
disponibilidade na natureza como um biomineral e a
estrutura adequada do poro para o carregamento de diversos materiais, características
que levam as micropartículas de CaCO3 serem usadas no
desenvolvimento de sistemas de liberação controlada de compostos bioativos
(VOLODKIN et al., 2004).

Suas partículas podem ser
encontradas em três diferentes polimorfos: vaterita
(μ-CaCO3), aragonita (λ-CaCO3)
e calcita (β-CaCO3), em uma ampla variedade de tamanho, forma e
estrutura cristalina com diferentes propriedades e características (BESSLER et al., 2008). A calcita tem uma
estrutura cristalina romboédrica e é o polimorfo mais termodinamicamente
estável em condições ambiente (SARAYA et
al., 2016). A aragonita (estrutura ortorrômbica)
se forma a altas temperaturas, enquanto a vaterita
(estrutura hexagonal) é o polimorfo mais instável e pode acompanhar a calcita
se a precipitação ocorrer a baixa temperatura (WANG et al., 2006).

A vaterita,
é um mineral escasso que pode ser formado a partir de carbonato de cálcio
amorfo, pois possui uma estrutura termodinamicamente instável, com capacidade
de transformar-se rapidamente em calcita ou aragonita
em solução aquosa (QIU et al., 2012).
Sua estabilização pode ser realizada por uma variedade de moléculas orgânicas
hidrofílicas (DOWNS, 2013).

Vaterita
é um importante material biomédico devido às suas propriedades como área
superficial específica elevada, alta solubilidade, alta dispersão e gravidade
específica pequena, sendo utilizada no desenvolvimento de sistema de liberação
controlada de compostos bioativos (TRUSHINA el at, 2014). Deste modo esta é a fase mais atraente do CaCO3
como matriz para a fabricação de materiais multifuncionais, com uma morfologia
esférica e superfície porosa é a forma de vaterita
metaestável. A vaterita passa facilmente pela
transição de fase para a fase mais termodinamicamente estável da calcita, a
qual não apresenta a morfologia esférica porosa como a vaterita
(VOLODKIN, 2004).

Segundo Kabalah, em seus estudos, identificou que a vaterita é composta de uma grande fase de simetria
hexagonal preenchida com nanodomínios amorfos
(KABALAH, 2013).

Diferentemente dos
polimorfos da calcita e aragonita, que têm cristais
facetados, partículas de vaterita são geralmente
esféricas ou irregulares (LEEUW, 1998), conforme Figura 1.

Figura 1 - Polimorfismo do carbonato de
cálcio (CaCO3)

Fonte: adaptado de Costa et al. (2017).

Em relação à preparação
das micropartículas de CaCO3, o aspecto mais importante é o controle
do polimorfismo, tamanho de partícula e morfologia do material (BOYJOO et al., 2014). Vaterita
pode ser estabilizado com vários compostos, entre eles a glicina, proteínas,
surfactante aniônico (COSTA et al.,
2017).

O objetivo deste trabalho
foi otimizar o processo de síntese de micropartículas de CaCO3 na
fase de vaterita na presença de um estabilizador de
fases apropriado e sob agitação vigorosa. A morfologia das micropartículas foi
investigada usando microscopia eletrônica de varredura (MEV).

2
MATERIAIS E MÉTODOS

Os experimentos de
precipitação das partículas de carbonato de cálcio foram realizados segundo a
metodologia descrita por Saraya e colaboradores (SARAYA et al., 2016), com pequenas
modificações. O processo de síntese foi baseado na reação de volumes iguais de
Na2CO3 1,0 mol.L-1 e
0,5 mol.L-1 CaCl2, na presença e ausência de um
estabilizador de fases a 25 °C com agitação constante. Os estabilizadores de
fase utilizados foram carboximetilcelulose (CMC) e
poliestireno sulfonado (PSS). A agitação aplicada ao meio reacional foi
avaliada com diferentes intensidades, sendo utilizado a agitadores magnéticos e
agitadores mecânicos de alta rotação. O fluxograma esquemático dos experimentos
está apresentado na Figura 2.

Figura 2 - Fluxograma esquemático das
formulações propostas para a síntese de vaterita

Fonte:
o autor

Todos
os reagentes utilizados foram de grau analítico e foi usada água deionizada em
todos os experimentos.

As
imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV) foram adquiridas
utilizando um equipamento EVOMA10 (Zeiss) com
filamento de tungstênio em 20 kV.

3
RESULTADOS E DISCUSSÃO

O processo de síntese das
micropartículas de CaCO3 foi baseado na precipitação química pela
reação de íons cálcio da solução aquosa de CaCl2 e íons carbonato da
solução aquosa Na2CO3.

O Quadro 1 mostra as
imagens de MEV obtidas após 10 minutos de reação sob agitação. Nas imagens
identificadas com as letra A e B são resultados da síntese sem a adição de
reagentes estabilizadores de fase, observa-se que os cristais formados pela
aplicação da agitação magnética, A, têm característica da fase estável calcita,
que tem sua cristalização em forma prismática com arestas bem marcadas, o mesmo
pode ser observado nos cristais obtidos com a aplicação de agitação mecânica,
porém nesta imagem, B, observa-se a coexistência de cristais prismáticos com a
formação de cristais com cantos suavizados, indicativo que aumentando-se o
vigor de agitação favorece a nucleação e o crescimento e consequente
precipitação de cristais arredondados. De toda forma, esta etapa do
procedimento prova a necessidade de um estabilizador de fase para a formação de
cristais de vaterita, que têm sua cristalização em
forma de esferas porosas, ideal para a aplicação na TFD.

QUADRO 1 - Imagens obtidas por Microscopia
Eletrônica de Varredura (MEV) dos cristais formados a partir das formulações
propostas

Agitação Magnética

Agitação Mecânica

Sem adição de estabilizador de fase

A

B

Adição de 2% CMC

C

D

Adição de 2% de PSS

E

F

Fonte: o autor

Em busca da estabilização
da fase vaterita, adicionou-se às soluções reacionais
2% de estabilizadores de fases, que segundo estudo conduzido por Downs (2013), a utilização de moléculas com caráter
polimérico favorece a estabilização dos cristais esféricos.

Ambos os estabilizadores
utilizados são responsáveis pelo aumento da viscosidade da solução, devido ao
seu caráter espessante que acredita-se os choques
efetivos dos íons seja controlado para a formação cristalina deste composto.

Porém observou-se que
somente a adição do estabilizador de fases não é suficiente para a manutenção
dos cristais esféricos de vaterita, o que pode ser
notado nas imagens C e E do Quadro 1.

Na imagem C, nas quais
foi adicionado CMC como estabilizador de fase, pode-se observar a formação de
aglomerados de partículas com cantos arredondados, porém a morfologia esférica
não é alcançada, isto é possivelmente devido à baixa taxa de cisalhamento
oferecida pela agitação magnética ao meio reacional, não sendo capaz de
oferecer energia suficiente para estabilizar termodinamicamente as esferas de vaterita. Comportamento similar é verificado na imagem E,
onde ocorre a adição de PSS. Comparando as imagens com adição de CMC e PSS, C e
E respectivamente, observa-se que a ação do PSS
adicionado é mais efetiva que a adição do CMC adicionado, pois verifica-se que
mesmo com agitação magnética, ocorre a formação de cristais arredondados e
porosos, o que não é claramente observado na imagem com adição de CMC.

A influência da taxa de
cisalhamento gerada pelo vigor da agitação evidenciada quando comparadas as
imagens D e F, com a adição de estabilizantes. Na imagem D, com adição de CMC e
utilização de agitação mecânica, observa-se partículas arredondadas, porém não
esféricas características da fase vaterita, o que
pode ser claramente observado na imagem F, onde estão apresentados os cristais
formados com a adição de PSS com agitação mecânica. Nesta imagem nota-se os
cristais arredondados e esféricos característicos da fase metaestável.

A manutenção da fase vaterita depende não somente de sua formação, mas estudos
indicam que acima de 40 °C esta fase atinge energia suficiente para
transformar-se em sua fase mais estável calcita (COSTA et al., 2017). Para isso estudos de estabilização desta fase ao
longo do tempo têm sido desenvolvidos pelo grupo de pesquisa a fim de
determinar as melhores condições de armazenamento destas partículas promissoras
para a aplicação em sistema de liberação controlada de fármacos.

4
CONCLUSÕES

Os experimentos
conduzidos neste trabalho mostraram que é necessário o controle dos parâmetros
para a estabilização da fase metaestável vaterita,
dentre eles a adição de compostos capazes de aumentar a viscosidade das
soluções reativas, assim como, devido ao seu caráter polimerizante,
estabilizar a fase na forma de esferas porosas, mesmo após a realização da
extração destes compostos. Outro fator relevante para a obtenção da vaterita estabilizada é a taxa de cisalhamento aplicada ao
meio reacional. Foi comprovado que somente a presença de um estabilizador não
fornece energia suficiente para estabilizar a fase vaterita,
assim, esse acréscimo de energia dada ao sistema reacional deve ser introduzido
pela energia cinética gerada pela agitação vigorosa possível em agitadores
mecânicos.

Estudos futuros pretendem
determinar o shelf-life
destas partículas e as condições de armazenamento adequado para a manutenção
das fases formadas.

5
AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem o
suporte financeiro da FAPESP (projeto n° 2018/18531-6).

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